Couplage Electrophorèse Capillaire/Spectrométrie de Masse (CE-MS) : application protéomique, protéines intactes et anticorps monoclonaux

Développement du couplage CE/MALDI-MS : applications à la caractérisation de protéines

L’identification et la caractérisation de protéines apparait comme un des défis les plus important posé aux sciences analytiques ces dernières années. En effet, les protéines et les peptides jouent un rôle primordial dans les voies de régulation biologiques ce qui implique le développement de techniques analytiques de plus en plus puissantes et sensibles pour répondre à cette demande constante de caractérisation et d’identification. L’équipe du LSMIS a mis au point une nouvelle interface CE/MALDI-MS automatisée, équipée d’une cellule UV/visible déportée, et d’une distribution automatique de matrice intégrée.

Ce nouveau système a été évalué sur des mélanges différents de protéines entières, de digestats de protéines et d’anticorps monoclonaux (mAbs). Les résultats obtenus lors de cette évaluation ont montré la complémentarité de la nouvelle interface avec les systèmes analytiques classiques. De plus, nous avons montré la première séparation et analyse de mAbs entier par CE/MALDI-MS. Cette  nouvelle interface apparait comme extrêmement prometteuse pour la caractérisation par approche Top Down de protéines entières et de mAbs. Enfin la combinaison du nouveau système CE/MALDI-MS avec le système CESI-MS a permis de développer au laboratoire une stratégie originale à 2 dimensions de séparation et de collecte de fractions suivi d’infusions par nanoélectrospray. Cette stratégie ouvre la voie à la caractérisation fine de protéines entières en conservant les propriétés de haute résolution de l’électrospray.

Développement du couplage CE/ESI-MS haute sensibilité : application à la caractérisation fine de protéines

La caractérisation complète des protéines est encore un véritable défi pour les sciences analytiques. L'électrophorèse capillaire (CE) couplée à la spectrométrie de masse par électrospray (ESI-MS) est une technique très approprié pour la séparation et la détection de protéines intactes et des mélanges de peptides. Depuis 1988, de nombreuses approches pour le couplage CE/ESI-MS ont été décrites. Cependant, en raison de son format miniaturisé; la CE souffre d'une capacité de charge très faible et d'une difficulté à maintenir le champ électrique.

 Une nouvelle interface "sheathless" CE-MS, appelée CESI-MS, permettant le couplage de la CE avec ESI-MS, a été développée par Sciex Separation. Dans un premier temps, le LSMIS a évalué l'aptitude du CESI-MS en tant qu'émetteur nanoESI pour l'analyse de protéines intactes et de complexes non-covalents. Cette étude ouvre de nouvelles voies pour la caractérisation de méga-structures biologiques. Dans un second temps, nous avons démontré l'aptitude du CESI-MS pour l'analyse protéomique de systèmes complexe comme le protéome mitochondrial de Yeast. Les performances de la méthode CESI-MS/MS ont été systématiquement comparés à la méthode de référence nanoLC-MS/MS. Les résultats ont confirmé la grande complémentarité entre le CESI-MS et la nanoLC-MS. En outre l'utilisation de la CE a permis d'augmenter le nombre de peptides identifiés. Ce résultat met en lumière la capacité du CESI-MS à renforcer la confiance de l'identification des protéines. Ceci renforce le couplage CE/ESI-MS comme méthode alternative aux approches chromatographique classiques.

Depuis Octobre 2011, Le LSMIS a été choisi par la société International Beckman Coulter Inc. (Maintenant Sciex Separation) afin d'évaluer la nouvelle interface CESI-MS. L'expertise du Dr. Yannis François en CE ainsi que celle des membres du laboratoire en MS ont permis au LSMIS de devenir un des centres référents en Europe dans le domaine des protéines intactes (protéines thérapeutiques) et des complexes non-covalents.

Caractérisation fine d'anticorps monoclonaux et des composés apparentés par CE-MS

Les anticorps monoclonaux (mAbs) connaissent un grand essor dans le domaine des protéines thérapeutiques pour les traitements de maladies humaines. Les mAbs exigent un grand nombre de technologies analytiques pour leur caractérisation complète. La spectrométrie de masse est devenue un outil essentiel pour la caractérisation des mAbs. L'électrophorèse capillaire est la méthode la plus souvent mises en œuvre dans l’industrie biopharmaceutique pour l'analyse de protéines thérapeutiques.

L'équipe du LSMIS développe de nombreuses approches CE-MS, avec des interfaces totalement originales (CESI-MS , CE-MALDI-MS) pour la caractérisation fine des mAbs et de ces dérivés (biosimilaires, Antibody-Drug congugates (ADCs)). Ce projet porte sur le développement de méthodes CE-MS par différentes approches (top down, bottom up et middle down) permettant de considérer la protéine thérapeutique aussi bien intactes que totalement ou partiellement digérées. Enfin, le laboratoire a pour but de but de de démontrer l’apport du nouveau couplage CESI-MS en tant que méthodes orthogonale dans le cadre de la caractérisation de protéines thérapeutiques.

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