Développement de la spectrométrie de masse pour l’étude dynamique des complexes non-covalents biologiques et chimiques

L’obtention des constantes de stabilité en plus d'informations structurales est essentielle pour une caractérisation complète des complexes non-covalents. La caractérisation poussée de ces édifices est nécessaire à la fois pour optimiser leur synthèse (chimie supramoléculaire) et pour comprendre leur mécanisme biologique (relations structure-fonction en biologie). Dans ce contexte, notre projet est principalement orienté vers le développement de la spectrométrie de masse pour caractériser les mécanismes de formation de ces systèmes supramoléculaires en déterminant leurs constantes de stabilité et en suivant leur cinétique de formation. Aujourd'hui la spectrométrie de masse supramoléculaire est avant tout un outil utilisé pour déterminer la stœchiométrie de ces complexes ; elle est encore peu utilisée pour leur étude thermodynamique (constantes de stabilités) et cinétique (suivi de formation). Notre objectif actuel est donc à travers l'étude des différents systèmes de déterminer les conditions dans lesquelles la spectrométrie de masse peut obtenir ces informations en démontrant notamment que le spectre de masse donne l'image qualitative et quantitative des espèces présentes en solution (par comparaison notamment aux résultats obtenus par d’autres techniques analytiques). Aller vers une caractérisation plus fine de ces complexes passe aussi par la définition de leurs zones d’interaction. Pour cela, nous avons développé des approches qui permettent l’identification au sein de chaque partenaire des acides aminés qui sont à proximité les uns des autres. Ces approches consistent à réaliser les cartes peptidiques des partenaires du complexe après les avoir chimiquement cross-linkés dans la conformation native du complexe.

Détermination des constantes de stabilité de complexes protéine-protéine

Ce travail a pour but de déterminer par spectrométrie de masse les constantes de stabilité des complexes protéine-protéine et protéine-ligand. Par exemple, grâce à cette stratégie, les constantes de stabilité de plusieurs complexes Adx/AdR (avec différents mutants d’AdX) ont pû être obtenues (collaboration Prof. Rita Bernhardt, Universität des Saarlandes). Dans ce cadre, les résultats de spectrométrie de masse sont combinés avec des études de “docking” protéine-protéine afin d'obtenir des informations complémentaires sur la façon dont les différents partenaires interagissent les uns avec les autres.

Etude de la formation de complexes protéiques de haut poids moléculaire

Dans le domaine de la biologie des voies respiratoires, l'objectif de ce travail est de déterminer l'influence des paramètres physico-chimiques (biotope oxygène, le sulfure, pression, température) sur la formation de complexes protéiques composés par l'association de plusieurs unités protéiques avec des masses moléculaires pouvant aller au délà de 1 Million de Daltons (collaboration avec F. Zal et A. Andersen, Station Biologique de Roscoff). Grâce à la spectrométrie de masse, nous obtenons des informations sur la stœchiométrie des complexes formés. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre la capacité d'adaptation des organismes aux environnements extrêmes. Dans ce contexte, la dénaturation des complexes en solution a été suivie par spectrométrie de masse.

De la mesure de la masse moléculaire vers la topologie

La détermination de la topologie des interactions, que l’on pourrait définir comme la détermination des points de contacts entre les différentes sous-unités, sera possible grâce à l’utilisation d’agents pontants (ou cross-linkers) possédant un bras espaceur de longueur courte et fixe. Ces propriétés permettent de considérer que seuls deux acides aminés très proches pourront être liés par une molécule de cross-linker. Après réaction avec le cross-linker, il sera possible de déterminer ces points de contacts  grâce à une approche Bottom-up, c’est à dire par identification des peptides cross-linkés par analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS), après digestion enzymatique (collaboration avec l’IGBMC à l’Université de Strasbourg). L’intégration de ces données dans un contexte plus général d’analyse de biologie structurale, permettra d’établir des cartes de réseaux d’interaction qui aideront à appréhender les dysfonctionnements cellulaires.

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